【干货分享】 影响干扰效率的因素

 

siRNA和shRNA简介

 

siRNA简介

小或短干扰RNA(small/short interfering RNA, siRNA)是一类20-25个核苷酸长度的双链RNA分子

依赖于RNA聚合酶启动子(pol Ⅲ),操纵一段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达。pol Ⅲ可以在细胞中表达多个小分子RNA,,通过3-6U来终止转录。

 

shRNA简介

小发卡或短发卡RNA(a small hairpin RNA or short hairpin RNA, shRNA)是一段具有紧密发卡环(tight hairpin turn)的RNA序列

shRNA的发卡结构可被细胞机制切割成siRNA,然后siRNA结合到RNA诱导沉默复合物上(RNA-induced silencing complex,RISC),该复合物能够结合到目的mRNAs并将其降解。

 

 

主要因素

 

发挥作用的部位01

 

 

研究表明,siRNA主要聚集在细胞质,而shRNA主要在细胞核中,理论上shRNAsiRNA干扰效果更好;干扰效率也可能与目的基因分布的位置有关。但是关于siRNAshRNA干扰效率不同的研究报道较少,尚不清楚其机制。

 

案例1

1)如图,小鼠体内实验将pGL3分别和siRNAshRNAsiLUC2pShagLUC序列相同)混合后,尾静脉注射小鼠体内,通过生物素活性检测发现,3hshRNAsiRNA干扰效率差距不明显,但6h,检测shRNA干扰效率较siRNA效果好。

2)分析3h内干扰效率无差距主要是siRNA转移细胞质和shRNA转移至细胞核同时发生。

 

 

细胞类型以及细胞不同的胚胎发展阶段02

 

 

案例1

研究表明,在小鼠体内用cre系统引导A1基因敲除,结果显示胸腺细胞中的RNAi干扰效率明显比淋巴细胞中的干扰效率高:

1)图左表明,A1基因在小鼠体内胸腺细胞和淋巴细胞中mRNA表达水平正常化。

2)图右表明,较野生型mRNA表达量,敲减后,胸腺细胞中A1 mRNA仅剩16%,显著低于淋巴细胞细胞。

3)并且淋巴细胞中,淋巴T细胞干扰效率较淋巴B细胞好。

 


 

 

案例2

研究表明,在成熟T细胞中,RNAi干扰效果普遍较其它细胞低,主要是成熟淋巴细胞经历RNAi后,其细胞能力受损(不影响细胞形态和增殖能力),无法发挥干扰作用。

如图,在成熟T细胞和NIH3T3纤维细胞中分别敲减不同的基因(A1,itch,Nedd),干扰效率差距明显。

 

 

细胞内siRNA/mRNA表达水平比例

03

 

案例1

研究表明,提高mRNA表达水平,干扰效率未提高,主要受siRNA/mRNA表达水平比例限制:

如图,提高胸腺细胞中A1 mRNA表达水平约6倍,NB检测siA1干扰效率未增加,说明每个siRNA所干扰的mRNA达到饱和,所以增加mRNA表达量,干扰效率很难增加,此时增加siRNA表达量可能是提高干扰效率的唯一途径。

 

 

 

案例2

研究表明,在不同细胞中,即使细胞内siRNA/mRNA表达水平比例一致,干扰效率也显著不同。

如图,巨噬细胞BMDM和淋巴细胞中siRNA/mRNA表达水平比例一致时,巨噬细胞中的干扰效率显著高于淋巴细胞。

 

 

 

RNAi信号通路蛋白的表达水平

04

 

参与干扰信号通路的基因包括,RNA诱导沉默复合物家族蛋白(ago1-ago4),dicer,exportin-5 (XPO5),RNA结合衰减蛋白(TRAP

 

案例1

ago2能够介导RNA被剪切来实现RNA降解,导致翻译受阻,可作为RNAi发挥作用的催化引擎。并且研究数据表明提高ago2表达水平能够增强干扰效率:

1)如图,将EGFP shRNA和干扰信号通路基因(ago2、dicer、XPO5)分别共同转入HEK293细胞中,增加ago2基因表达水平显著提高shRNA的干扰效率,而其它RNAi信号通路蛋白,随着表达水平的增加对RNAi干扰效率无作用。

 

 

2)并且ago2/shRNA表达水平比例越高,干扰效率越好

 

 

 

案例2

RNase Ⅲ dicer是dsRNA剪切成siRNA过程中不可或缺的酶。研究数据表明提高dicer表达量,能够增强干扰效率:

如图,通过双荧光素酶实验,将dicer表达质粒载体或对照载体和shRNA共同转入hela细胞中,检测荧光素酶活性,结果表明提高dicer表达量,荧光素酶活性显著下降,即干扰效率增强。

 

 

shRNA序列设计

05

案例1

shRNA序列长度影响干扰效率:

如图,设计不同长度的EGFP shRNA,在HEK293细胞中检测到,碱基序列为19-21bp时的干扰效率较18bp和22bp时更好。

 

 

 

案例2

loop环大小为6nt或9nt时,并且shRNA结构为正义链-loop环-反义链时的干扰效率最好。

如图,研究数据表明,loop环大小为6nt或9nt时较4nt的干扰效率明显好,并且shRNA结构为sense-loop-antisense时,干扰效果更好。

 

 

案例3

loop环碱基序列影响基因干扰效率:

如图,研究表明将目的基因序列克隆在荧光素酶报告基因载体的3’UTR端,分别与不同的shRNA载体共同转染HEK293细胞中,通过分析荧光素酶活性发现,5-nt loop环上额外的2个碱基对RNAi干扰效率不可或缺。

 

 

案例4

loop环碱基序列影响基因干扰效率:

研究表明,通过将常用的shRNA间隔序列TTCAAGAGA 替换成 ATCAAGAGA序列后,shRNA干扰效果显著增强。

 


 

 

总结-(提高干扰效率的方法)06

 

 

1. 避免用淋巴细胞做干扰实验;

 

2.提高RNAi/mRNA表达水平比例,提高干扰效率,主要途径是提高siRNAshRNA表达水平;

 

3.提高ago2dicer基因表达水平,提高干扰效率;

 

4. loop环序列可换成 ATCAAGAGA;

 

5. 设计shRNA碱基序列为19-21bp。

 

 

参考文献:

[1]Deming Gou.A new design of a lentiviral shRNA vector with inducible co‑expression of ARGONAUTE 2 for enhancing gene silencing efficiency[J].Cell & Bioscience,2015

 [2]Klaus Rajewsky.Efficiency of RNA Interference in the Mouse Hematopoietic System Varies between Cell Types and Developmental Stages[J].MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY,2005
[3]Ben Berkhout.Optimization of shRNA inhibitors by variation of the terminal loop sequence[J].Antiviral Research,2010
[4]Kazunari Taira.Overexpression of Dicer enhances RNAi-mediated gene silencing by short-hairpin RNAs (shRNAs) in human cells[J].Nucleic Acids Symposium Series,2004
[5]KEVIN G. RICE.Potency of siRNA Versus shRNA Mediated Knockdown In Vivo[J].Wiley InterScience,2007
[6]Tuva Barøy.shRNA Expression Constructs Designed Directly from siRNA Oligonucleotide Sequences[J].Mol Biotechnol,2010
[7]Ashok A. Deniz.siRNA in human cells selectively localizes to target RNA sites[J].PNAS,2006
[8]John Nemunaitis.siRNA vs. shRNA: Similarities and differences[J].Advanced Drug Delivery Reviews,2009

 

 

End

今天的干货就分享到这里了

关注福德正神登录随时获取干货、福利以及活动

 

Chinese, Simplified